IR983F細胞，大鼠骨髓瘤細胞株

IR983F細胞，大鼠骨髓瘤細胞株 簡介：

細胞名稱：IR983F細胞

中文名稱：大鼠骨髓瘤細胞

生長狀態：貼壁生長

來源：美國ATCC

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1.試劑和溶液

1）轉印緩沖液：0.025M Tris base , 0.187 M甘氨酸 , 25%甲醇

2）氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B

3）1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl ,0.1%Tween 20

4）封閉液：TBST配制的5%牛奶

5）抗體稀釋液：TBST配制的5%牛奶

6）顯色系統：ECL顯色

2.實驗步驟

1電泳：將裂解液進行SDS-PAGE電泳，80v，30分鐘，120v，90分鐘；

2轉膜：PVDF膜在甲醇中浸泡約30秒左右，濾紙浸泡在轉印緩沖液預濕，半干法轉印到PVDF膜上，10v，150分鐘；

3染色：氨基黑染色5分鐘，甲醇褪去背景色，觀察條帶；

4膜活化：將PVDF膜置于甲醇活化1min，用純水洗膜2次后再用TBST洗滌3次；

5封閉：將膜條置于5%牛奶或2% BSA中，室溫混搖2h；

6一抗孵育：將待檢抗體用3%牛奶或2% BSA稀釋到合適濃度（參照抗體說明書，根據客戶預實驗結果，稀釋度上下浮動一個數量級都為正常），將膜放入對應的已稀釋待檢樣品中，置4℃混搖孵育隔夜；

7洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；

8二抗孵育：將膜取出放入稀釋好的HRP標記的二抗（參照二抗說明書進行稀釋）中，室溫混搖2h；

9洗滌：取出膜放在TBST中洗滌3×5min；

10ECL顯色：將膜取出放入混勻的ECL顯色液中，孵育3min，將膜取出貼在有熒光角標的膠片上，迅速用保鮮膜包好；

11曝光：把底片放在暗盒中，根據熒光強度分別對X光膠片作不同時間段的曝光，曝光結束后，將底片取出，1min顯影，30s清洗，1min定影，30s清洗，晾干；

12結果分析：用掃描儀將曝光后的X光膠片掃描，做后續結果分析。

選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。

注意:細胞株的生物等級，由于有些細胞株及菌株屬于管制品，所以從國外購貨比較麻煩。

形態學改變:細胞體積明顯增大,為成熟淋巴細胞3-4倍。核膜清晰,核染色質疏松呈網狀。核內見明顯核仁1-4個。胞漿豐富,嗜堿性,有偽足樣突出。胞漿內有時可見小空泡。

細胞培養是一種無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔、空氣清新，干燥和無煙塵。細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養于一室，而洗刷消毒在另一室。

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invitrogen PHG0313    EGF Recombinant Human Protein   1 mg

invitrogen PHG0314    EGF Recombinant Human Protein   10 µg

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