MC3T3-E1 MC3T3-E1細胞株

lncRNA 的研究已經在世界范圍內變得越愛越熱門，通過這些年的研究，lncRNA的機制研究也形成了一定的套路：

1）高通量分析lncRNA的表達；

2）驗證高通量篩選后的結果；

3）研究lncRNA與蛋白之間的相互作用。

接下來的文章中，慧穎生物會和大家一起討論lncRNA機制研究中常用的方法，歡迎小伙伴們積極參與討論。

（一）高通量分析lncRNA 的表達

隨著lncRNA研究的不斷深入，現在已經有了很多很成熟的lncRNA芯片產品，可供選擇。另外二代測序的興起，也使得RNA-seq成為分析lncRNA表達譜的有效手段。當然從費用的角度講，lncRNA 的芯片更便宜，二代測序RNA-seq的成本更高。不過土豪請隨意！

應用lncRNA芯片或者RNA-seq進行lncRNA表達譜分析的研究已經有了很多。例如，Orom等人在人類的細胞系中通過lncRNA的芯片篩選，鑒定了3019條lncRNA的表達分布。另外，Ng等通過定制化的lncRNA芯片（customized microarray）研究了人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESCs）內的lncRNA表達譜（expression profile）。他們發現有一些胚胎干細胞特異性的lncRNA對于維持干細胞的多能性（pluripotency）有非常重要的作用。在腫瘤研究（乳腺癌、胰腺癌、肝癌等）中，lncRNA芯片的應用也是非常地廣泛。

相對于lncRNA芯片在表達譜研究方面的廣泛應用，RNA-seq方法的應用領域則明顯地不同。RNA-seq 主要用于研究轉錄組。應用該方法，獲得的結果受到的干擾信號（background signal）比較低，更重要的是，通過RNA-seq有可能獲得全新的轉錄產物（當然包括lncRNA在內，但是不局限于lncRNA。例如在腫瘤研究中，常用RNA-seq去發現新的融合基因。利用RNA-seq技術，研究人員發現某些lncRNA分子在神經精神疾病（neuropsychiatric disorder）中發揮重要作用。另有研究者通過RNA-seq技術，分析了肝細胞癌（HCC）中的整個轉錄組，當然也包括了lncRNA。

（二）對于高通量數據的驗證

常用的驗證高通量數據的實驗手段有：Northern blot、qRT-PCR、FISH及RNAi 等方式。

目前zui為常用的檢測lncRNA表達的手段是qRT-PCR，它的操作簡單，自動化程度高，在實驗室普遍使用。FISH的實驗方法，使用的實驗室就相對較少。FISH和Northern 類似的地方是，它同樣是基于分子雜交的原理。使用FISH的一大優勢是，它不僅可以表征lncRNA表達量的多少，更可以直觀地告訴研究者lncRNA在亞細胞/組織中的定位。

研究者成功地使用該方法研究了多條lncRNA，包括Xist、MALAT1、MENε/β和Kcnq1ot1等。RNAi是另一種廣泛使用的實驗手段，在細胞中特異性地敲減lncRNA，是檢測lncRNA功能時，zui常用的實驗方法。例如，HOTAIR的5'區域和3'區域可以分別結合PRC2和LSD1，并起到一個腳手架（Scaffold）的作用。研究者通過RNAi的方式，敲減細胞內源性HOTAIR分子，證實了該分子在結構上的作用和功能。需要注意的是，以上的多種方法可以相互結合，以驗證篩選獲得的lncRNA的表達及其可能發揮的功能。

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