9L細胞

染色質免疫沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的一種技術。它利用抗原抗體的特異性反應，可以真實地反映體內蛋白分子與基因組DNA結合的狀況。下面我們就zui基本的實驗步驟，實驗中的小技巧以及需要注意的問題簡單介紹一下。

1.  細胞固定

    甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鐘到1個小時。需注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不*，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。

2.  染色質片段化

    交聯后的染色質需被超聲波切成400~600bp的片段，以便目的蛋白的暴露，利于抗體識別，其片段破碎的均勻一致性對結果影響至關重要。傳統的超聲波破碎是利用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。而來自比利時的Bioruptor非接觸式超聲波破碎儀采用溫和的破碎方式，保證了蛋白的活性，DNA破碎效果均一，同時外接水循環儀保證了實驗的溫度穩定性，成為目前ChIP實驗的。

3.  染色質免疫沉淀反應

Input對照：

在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照。Input需要與沉淀后的樣品DNA一起經過逆轉交聯，DNA純化，以及zui后的檢測。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗*的步驟。

Beads選擇：

接下來，利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原-抗體特異反應形成DNA-蛋白質-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magnabeads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的DNA片段。再經過多次洗滌，除去非特異結合的染色質后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。

抗體選擇：

染色質免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關鍵。因為在蛋白質與染色質交聯結合時，抗體的抗原表位可能因為與結合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結果。

陰性對照設置：

在做ChIP實驗時，需設置對照，以便于對實驗結果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是zui基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNAPolymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結果與陽性抗體和陰性抗體的結果相比較，才能得出正確結論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。*的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質免疫沉淀檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質免疫沉淀實驗的檢測。

4.  交聯反應的逆轉和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65℃保溫6小時逆轉交聯，經DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。在逆轉交聯時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質，進行分析。

5.  DNA的鑒定

zui常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區域序列多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同，因此可設計多對引物來反復驗證ChIP實驗的結果.

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以下為購買細胞系后的售后小知識：

1、CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？

定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

2、為何培養基保存于4 ℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？

培養基保存于4 ℃ 冰箱中， 培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。

3、各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細胞沒有太大之影響， 惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

4、購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？ 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養時出現存活率不佳， 常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80℃太久。

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