細胞活化和復蘇

                                      細胞活化和復蘇

1. 收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。

細胞復蘇的原則－快速融化：

必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

具體操作

一. 實驗前準備：

1.將水浴鍋預熱至37℃

2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。

二．取出凍存管：

1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。

2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。

三．迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。

2.約1-2min后凍存管內液體*溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。

四.平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min

五.制備細胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。

六.細胞計數：細胞濃度以5×105/ml為宜。

七.培養細胞將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。

初學者易犯錯誤：

1水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。

2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。

3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。

4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。

（另：冷凍細胞解凍程序）

2.1. 依據細胞株數據單之基礎培養基種類、血清種類和其它之成份和比例， 制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。

2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單之血清種類培養之。

2.3. 將培養基置于 37 °C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。

2.4. 依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取 10 ml培養基加至 T25或 T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養基， 混 合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養箱培養。

2.5. 對絕大多數細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。唯對極少數因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中,離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后， 轉移至培養瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養箱培養。收到T25 flask 細胞時， 處理方式為︰

1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養箱中，使細胞回溫至37 °C， 并讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask內之培養基，(取出之培養基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養基于flask 內，依 一般培養方式再將細胞置入培養箱中或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養。