家兔BMSC分離培養步驟

家兔BMSC分離培養步驟 

1. 麻醉、備皮、消毒、鋪巾：取1只4-5周齡新西蘭幼兔，速眠新肌肉注 射(0．1～0．2mL／kg)麻醉。仰臥固定于操作臺上，褪毛，備皮，2%碘酒、75%酒精（或碘伏）常規消毒，鋪洞巾(洞巾孔洞應控制在lcm左右，以利于減少污染)。 

2. 在雙側踝關節處環形剪開皮膚，再縱行剪開皮膚至骶尾部，分離肌肉、 筋膜等軟組織至見骨膜，電鋸離斷踝關節、膝關節及髖關節，獲取家兔股骨和脛骨（橈骨）,置于裝有PBS液的無菌盒內。（亦可從髂前上棘穿刺抽取骨髓） 

3．用PBS液體清洗骨組織3-4遍，去除雜物、血跡后，在超凈工作臺上， 無菌條件下剝離骨周圍的肌肉軟組織，用眼科剪從股骨和脛骨的干骺端打開骨髓腔，用含有適量肝素( 625 U/mL)的DMEM 液沖洗骨髓腔，收集沖洗液約 6 ～ 8 mL。吸管反復吹打后，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。加入 DMEM 培養基重懸，將上述細胞重懸液按照 1∶ 1 的比例緩慢滴加到密度為 1. 073 g/mL 的PercoⅡ分離液中，1 500 r / min 離心 20 min。離心后管內容物分為 3 層，收集中間乳白色云霧狀的單個核細胞層，加入 DMEM 培養液稀釋混勻，1 500 r/min 離心 5 min，洗滌 2 ～ 3 次，去除多余的脂肪細胞及組織液。用含雙抗的 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培養基重懸細胞，以 2. 0 × 10^5個/cm2的細胞密度接種于25cm^2培養瓶中，置于 37 ℃，5%、飽和濕度的孵箱中培養。

4. 48小時后半量換液，去除浮物及其它非貼壁細胞（如造血干細胞），后每隔3天換液一次。 

5. 7-10天后，待細胞融合長滿至80%以上時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。 經過*次傳代后，骨髓間充質干細胞大約能占60%左右，并且呈漩渦狀生長；一般經過3次左右傳代后，骨髓間充質干細胞大約能占90%左右。