如何選擇抗體

如何選擇抗體

1.定制單抗還是多抗？
首先應該考慮的就是定制的抗體是應用于什么實驗，需要的量是多少？

對于科研用戶來說
1. 抗體常常應用于WesternBlotting、IP等實驗中，對于抗體的特異性有一定的要求，但并不是特別的強調
2. 往往在研究很多新的蛋白時，并不確定新蛋白是否很重要，是否會是將來很長一段時間的研究重點，所以抗體用量也不大所以針對科研用戶，在定制新的蛋白的抗體時，我們強烈建議首先制備多抗用于實驗，當得到了理想的實驗結果并需要長期的使用該抗體時再考慮制備單抗。當然，如果您對該抗體的特異性要求特別高（多抗的特異性已無法滿足實驗要求，比如應用于流式細胞術等）時，還是應該定制單抗

對于工業用戶來說
1. 抗體往往應用于檢測定量實驗或者功能性實驗，對于抗體的特異性要求非常之高
2. 目標蛋白基本上都是已知的確定有相當商業開發價值的，而且產品一旦形成，用量會非常大所以針對工業用戶，基本上可以直接定制單抗

2.該選多肽還是蛋白作為抗原呢？

需要根據抗體應用于什么實驗，以及您所能獲得的材料來決定
 
 1. 實驗過程中蛋白處于天然狀態，這時使用的抗體識別的一般是蛋白的構象表位和線性表位；這樣的實驗主要有CO-IP、FACS、Neutralizing/Blocking以及Elisa法檢測天然蛋白等
2. 實驗過程中蛋白處于變性或半變性狀態，這時大部分的構象表位已被破壞，抗體識別的一般都是線性表位；這樣的實驗主要有：Western、IHC/ICC/IF等以多肽作為抗原制備的抗體，識別的是線性表位，在使用時蛋白處于變性或半變性狀態下，結果可以令人滿意；但不能夠保證識別天然蛋白以蛋白作為抗原制備的抗體，識別蛋白的線性和構象表位，基本上所有的實驗都可以應用，所以，用蛋白作為抗原應是，但是在多肽抗原已可滿足實驗要求而且得到蛋白有一定難度的情況下，以多肽作為抗原制備抗體更加合適。

3、什么情況應該考慮用設計多肽做抗原？

答：如果氨基酸序列已知，但是由于基因克隆或表達等原因得不到抗原蛋白，或者僅需要得到針對抗原蛋白某幾個特定表位的抗體，就可以采用多肽合成的方式得到抗原。例如僅需要生產針對蛋白質某個區域的特異抗體，比如研究蛋白質N端的前體物，可以設計N末端的多肽抗原。如果抗體的使用目的是識別修飾的氨基酸，如磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸或者酪氨酸，乙酰化賴氨酸等，就必須對多肽進行相應的修飾。一般情況下抗血清能夠識別用來免疫的多肽序列，但是不一定識別天然蛋白質的折疊結構。非連續性抗原的抗體能否識別抗原決定簇取決于用于抗體生產的多肽是否存在二級結構。

4、設計多肽做抗原時的幾點基本原則？

答：識別區域的選擇原則一般說來的抗原性識別區域應具備親水、位于蛋白表面和結構上易變形性等特點。既要考慮其免疫原性、特異性，還需考慮其合成難度等。通常有以下幾點建議：1、序列長度在8-20個氨基酸殘基之間（如果太短，就有多肽太特殊、所產生的抗體與天然蛋白之間的親和力（結合能力）不夠強的風險，同樣，如果序列長度超過20，將有可能引入二級結構，所產生的抗體失去特異性的可能，而且肽鏈越長，通常合成難度增大，不易獲得高純度的產品）；2、盡可能是在蛋白表面；3、保證該段序列不形成α-helix；4、N，C端的肽段比中間的肽段更好；避免蛋白內部重復或接近重復段的序列；5、避免同源性太強的肽段；6、交聯可以交聯在N，C兩端，選擇依據就是交聯在對產生抗體不太重要的一端；7、序列中不能有太多的Pro，但有一兩個Pro有好處，可以使肽鏈結構相對穩定一些，對產生特異性抗體有益。

5、原核表達含GST標簽的蛋白制備抗體時，需要切掉GST標簽嗎？

答：如果目的蛋白很大且之后的實驗不受GST影響的話，GST標簽是不用切掉的。但是如果目的蛋白小于20KD的話，建議通過實驗切除GST標簽。

6、抗體的保存：

答：小包分批，避免多次反復凍融。短期：4度冰箱保存。長期：-20度，一般需要加入甘油，BSA等。

7、關于抗原的常識

對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原，可取1×107個細胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加*福氏佐劑并經充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。還有一些半抗原，如多肽，在免疫之前是需要耦聯一些蛋白，如KLH，BSA等。病毒類的抗原，可以直接用于免疫。如果是蛋白，一般來說，蛋白的純度要在90％以上，濃度在1mg/ml以上，分子量>10kd。一般融解在無毒的緩沖液中，建議溶解在PBS中

1. 根據實驗

ELISA、熒光免疫組化的抗原可能是線性表位，也可能是構象表位；而石蠟切片酶免疫組化、WB實驗過程中涉及蛋白變性，因此只能用識別線性表位的抗體，如果用ELISA、熒光免疫組化抗體不一定有反應。

2. 根據你的標本的物種來源  

如來源于人，抗體就選鼠抗人、兔抗人…

一抗要與二抗相匹配，如果一抗是小鼠來源，那二抗就買抗小鼠的；一抗是兔來源，二抗就要抗兔的。例如，檢測人組織細胞因子IL-4，一抗假如是mouse抗人（來源于mouse），二抗就用兔或羊或大鼠等抗mouse的;

3. 抗整個分子還是抗某個亞基

如一些受體分子由不同亞基組成，需要用不同單抗；

4. 單克隆or多克隆抗體

單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對低；多克隆抗體特異性稍弱，親和力強，靈敏度高，但易出現非特異性染色.

表達量相對較高的抗原，盡量選擇單克隆抗體；不明確表達量情況，且有經濟限制和時間限制的情況，可以選擇多克隆抗體。