大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)

           大鼠神經(jīng)元細(xì)胞的原代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的細(xì)胞會不可避免地存留少量異質(zhì)細(xì)胞一同生長．為了后續(xù)實驗結(jié)果的針對性和準(zhǔn)確性，一般都需要對培養(yǎng)物進(jìn)行純化。純化神經(jīng)元的方法有很多種，zui簡便及常用的是采用有絲分裂抑制劑阿糖胞苷來抑制異質(zhì)細(xì)胞的存活和生長。神經(jīng)元的分化增殖完成于胚胎期，大部分神經(jīng)元在出生后即為*的分裂后細(xì)胞，但其他細(xì)胞則仍然不斷地進(jìn)行分裂增殖，

使用有絲分裂抑制劑后，非神經(jīng)元的細(xì)胞生長會受到抑制及淘汰，神經(jīng)元由此得到純化

實驗材料：Hanks液，DMEM培養(yǎng)基10ml，有刻度吸管兩只，彎頭吸管兩只，無刻度吸管一只，新生乳鼠（24小時）0.05%胰酶，1%雙抗，10%胎牛血清，培養(yǎng)皿，小燒杯，空的離心管，鑷子，剪刀，酒精燈，酒精棉，

實驗前準(zhǔn)備工作：肥皂洗手，新吉爾滅擦手，開通風(fēng)柜，將吸管從套筒中取出放入各自對應(yīng)的試管內(nèi)，將橡皮塞安裝到各自吸管上，酒精燈分別迅速灼燒，

1配液Hanks液近40ml加1%雙抗1ml，加完雙抗的小吸管留作計數(shù)，在DMEM培養(yǎng)基中加10%胎牛血清（已配好，全部加入），從離心管取一滴碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至溶液呈紫色，一離心管0.05%胰酶，

2.取材。乳鼠新生24小時。

3，洗滌剪碎，在培養(yǎng)皿中加入少許Hanks液洗滌，將乳鼠頭部用酒精棉擦拭消毒，在乳鼠頭部位置剪一個工字型切口，將皮膚顱骨沿著切口依次剪開剝離，取出大腦組織，并去除乳鼠的血管腦膜，用彎頭吸管將Hanks液與剝離干凈的腦組織移走到另一個干凈的培養(yǎng)皿中，用彎頭吸管洗走洗液，彎頭吸管將含有腦組織的Hanks移入到小燒杯中剪碎，每個組織塊近似一立方毫米，靜置后洗走上面的Hanks液，（吸取Hanks液時勿將下面的組織塊洗走），同樣方法再用Hanks液洗滌一次

4．酶解，加一離心管0.05%胰酶，將上述小燒杯中的組織液移入空置的離心管中，37攝氏度水浴10分鐘，觀察組織塊是否變小，靜置2分鐘，使組織沉淀下來，棄掉上請胰酶后，加DMEM培養(yǎng)基（全部倒入）來中和胰酶，吹散組織液

5.離心1200轉(zhuǎn)每分鐘，離心5分鐘，棄掉上清液，沉淀后加Hanks液吹散重懸組織液，用同樣的轉(zhuǎn)速和時間在離心一次，加*培養(yǎng)基3-4mL吹散，靜置1分鐘，以便消化大塊組織

6.計數(shù)，取0.1ml離心后的細(xì)胞液加入苔盤藍(lán)染色，加樣搶加0.1微升與計數(shù)板計數(shù)，同時剩余細(xì)胞液加入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)接種，標(biāo)注好組別和時間，培養(yǎng)細(xì)胞的名稱37攝氏度，二氧化碳培養(yǎng)箱中，下周實驗課觀察細(xì)胞培養(yǎng)情況。

7.計數(shù)結(jié)果：2.3×10⁶ ml

注意事項：

1. 實驗前保證乳鼠在冰塊內(nèi)冰凍數(shù)分鐘，頭朝下將乳鼠插入冰塊內(nèi)，
2. 玻璃腦膜血管時動作要迅速，以免乳鼠蘇醒
3. 酒精燈應(yīng)放在離操作界面不遠(yuǎn)處，保證其溫度
4. 用彎頭吸管吸取Hanks液時手腕旋轉(zhuǎn)
5. 第二遍在小燒杯中用Hanks液洗時，要保證上請洗干凈，否則胰酶濃度將會減低
6. *次水浴加熱時唔超過10分鐘，以免胰酶對組織產(chǎn)生損傷
7. 吹打時避免大力以及吹打出氣泡，氣泡會導(dǎo)
8. 致細(xì)胞破裂。吹打頻率可與秒表同步以保證每次操作的穩(wěn)定性和重復(fù)性。