elisa細(xì)胞裂解液獲取方法

 elisa細(xì)胞裂解液獲取方法

細(xì)胞裂解是改變細(xì)胞通透性和活性的重要實(shí)驗(yàn)方法。通常我們都會想到用RIPA裂解液提取的蛋白做elisa，但是這個方法不太推薦，從提取蛋白自身的角度來考慮，RIPA裂解液可以使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)破壞，即破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結(jié)構(gòu)，從而使抗原決定簇得以充分暴露在外，更有利于被檢測出來；而從試劑盒本身的角度來考慮，以雙抗體夾心法為例，提取的蛋白中含有RIPA裂解液，當(dāng)加入到包被的孔板當(dāng)中時，可能同樣會對孔板中的包被的抗體起到了裂解作用（如SDS），從而使其失去該有的特異性，這方面可能需要考慮在內(nèi)的。

下面我們推薦另外2種比較好的獲取細(xì)胞裂解液中蛋白的方法：

1、         凍溶法，是一種常用的機(jī)械裂解方式比，通常由冷凍和解凍兩部分組成（freezing and thawing），。原理：由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。冷凍通常在液氮或-20°C冰上進(jìn)行，解凍可以在37、50、65 或100℃水浴中進(jìn)熱休克比化學(xué)裂解溫和，但是很有效，有資料表明用熱休克和溶菌酶與SDS的方法獲得了90%的細(xì)胞裂解率。如果需求的蛋白表達(dá)很低，我們可以用細(xì)胞裂解液作輔助，方法是先用裂解液室溫裂解一小時，然后反復(fù)凍溶三次。一般可以裂解到8ug/ul。切記裂解細(xì)胞時不要加太多裂解液，而且避免過多的反復(fù)凍溶。

2、         超聲波處理（Ultrasonication）既利用超聲加熱的方法，把細(xì)胞破碎。但這種處理會導(dǎo)致DNA 的斷裂，所以加熱不宜過劇烈，要設(shè)定好超聲時間和間隙時間，一般超聲時間不超過5秒，間隙時間大于超聲時間，這些都有利于保護(hù)酶的活性。bead-beating 也是常用的機(jī)械處理方式，有報道指出bead-beating 比熱休克和化學(xué)裂解的細(xì)胞裂解效果更好 雖然DNA產(chǎn)量較高，但通常得到的dna片段較小。

3、         Western Blot方法，方法步驟主要以下：

1）一瓶細(xì)胞（100ml的瓶子），PBS洗2次，胰酶消化，加入10ml 培養(yǎng)液，制備成細(xì)胞懸液；

2）細(xì)胞懸液移入10ml離心管中，4。C，2500rpm，離心5min；

3）上清，加入預(yù)冷的PBS（即4。C存放的PBS）于離心管中，吹打，4。C，2500rpm，離心5min；棄上清，重復(fù)上述步驟一次；共洗細(xì)胞2次，充分洗掉培養(yǎng)液；

4）上清，加入200ul細(xì)胞裂解液（每1ml裂解液中加入10ulPMSF），置于冰上，裂解40min～1h；裂解過程中可用槍頭吹打或間斷搖動離心管，以使蛋白充分裂解；

5）出離心管，于4。C，12000rpm，離心5min；

6）上清移入EP管中，-20。C保存，即可。

細(xì)胞裂解機(jī)制被廣泛應(yīng)用于各類的生物實(shí)驗(yàn)中。為達(dá)到*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要注意的是所有的實(shí)驗(yàn)步驟都需在四度以下進(jìn)行，并且避免過多的反復(fù)凍融。而且整個實(shí)驗(yàn)過程中記得戴手套。

綜述來源：慧穎生物免疫實(shí)驗(yàn)室

：王

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