原代細胞培養(yǎng)和傳代--注意事項

初代培養(yǎng)
原理 
    將動物機體的各種組織從機體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。     
儀器、材料及試劑 
    儀器：培養(yǎng)箱（調整至37℃），培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱（37℃） 
    材料：動物組織塊 
    試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒
初代消化培養(yǎng)法
1. 準備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面，紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2. 布局：點燃酒精燈，安裝吸管帽。
3. 處理組織：把組織塊置于燒杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如懷疑組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60分鐘。
4. 剪切：用眼科剪把組織切成2~3毫米大小的塊，以便于消化。加入比組織塊總量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結扎瓶口或塞以膠塞。
5. 消化：或用恒溫水浴，或置于37℃溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應搖動一次，如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
6. 分離：在消化過程中見消化液發(fā)混濁時，可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細胞團或單個細胞，立即終止消化，隨即通過適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速（500~1000轉/分）離心消化液5分鐘，吸出上清，加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
7. 計數(shù)：用計數(shù)板計數(shù)，如細胞懸液細胞密度過大，再補加培養(yǎng)液調整后，分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說，pH要求在7.2~7.4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說明液體變酸，可用NaHCO3調整。
8. 培養(yǎng)：置于36.5℃溫箱培養(yǎng)，如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時需要換新塞。
初代組織塊培養(yǎng)法
1. 剪切：把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸靜Hanks液，用眼科剪反復剪切1mm3塊為止。
2. 擺布：用彎頭吸管吸取若干小塊，置于培養(yǎng)瓶中，用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部，小塊相互距離以0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30塊。
3. 輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，另瓶底向上，注意翻瓶時勿另組織小塊流動，塞好瓶塞，置36.5℃溫箱培養(yǎng)2小時左右（勿超過4小時），使小塊微干涸。
4. 培養(yǎng)：從微箱中取出培養(yǎng)瓶，開塞，46度斜持培養(yǎng)瓶，箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉過來，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。
傳代培養(yǎng)法
原理 
    細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時
也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。 傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
材料和試劑 
1. 細胞：貼壁細胞株 
2. 試劑：0.25％胰酶、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清） 
3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等
   操作步驟
1. 吸除培養(yǎng)瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液。
2. 向瓶內(nèi)加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中2~5分鐘，當發(fā)現(xiàn)細胞質回縮，細胞間隙增大后，立即終止消化。
4. 吸除消化液，向瓶內(nèi)注入Hanks液數(shù)毫升，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已松動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液沖洗，直接加入培養(yǎng)液。
5. 用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6. 計數(shù)板計數(shù)后，把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中，置溫箱中培養(yǎng)。
無菌操作注意事項 
1. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。 
2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。 
3. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。 
4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。 
5. 瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。 
6. 吸溶液的吸管等不能混用。

來源：慧穎生物實驗室

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