定量檢測總黃曲霉毒素ELISA試劑盒研制

 　　材料與方法
 　　材料 ELISA試劑盒    
　　主要儀器  CO2培養箱（美國Queue公司）；豬ELISA試劑盒潔凈工作臺（北京半導體設備一廠）；生物倒置顯微鏡（日本歐林巴斯光學株式會社）；酶標分析儀（瑞士SUNRIS公司）；ELISA試劑盒價格電子分析天平（瑞士Mettler公司）；上海ELISA試劑盒低溫高速離心機（德國Hermle公司）；電泳儀（美國BIO-RAD公司）等。

 　　試劑  AFB1-BSA、禽ELISA試劑盒黃曲霍毒素（B+G）（Aflatoxin B+G）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）白介素ELISA試劑盒、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）、T-2毒素（T-2toxin）、赭曲霉毒素A（OchratoxinA）、展青霉素（Patulin）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivslenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、匙孔嘁血藍素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、伏馬菌素B1、抗體亞類測定試劑盒（IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3）（美國Sigma公司）；RPMI1640培養基、選擇性培養基、福氏佐劑（*、不*）、二甲基亞砜（DMSO）、吐溫20（Tween20）、聚乙二醇（PEG，MW5000）、青霉素，鏈霉素（美圍Gibco公司）；辣根過氧化物酶羊抗鼠IgG（北京中山試劑公司）；30％H2O2（優級純，北京化工廠）。

 　　溶液系統ELISA使用液  參考文獻［3］制備。

 　　細胞系與實驗動物  小鼠骨髓瘤細胞系Sp2／0由本室傳代，并經8一氮雜鳥嘌呤處理。雌性BALB／c小鼠，體重18～20g（軍事醫學科學院實驗動物研究所動物繁育場）。

 　　抗總黃曲霉毒素雜交瘤細胞株  本研究室自制。

 　　方法
　　 單克隆抗體生產  將抗總黃曲霉毒素雜交瘤細胞注入BALB/c小鼠腹腔，獲得含抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的腹水，并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進行純化〔4〕。
 　　抗體特性鑒定  抗體的免疫球蛋白類別及亞類鑒定采用抗體亞類鑒定試劑盒；抗體的純度及分子量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測定；IgG含量采用二喹呆甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒進行測定；抗體滴度測定采用間接非競爭ELISA方法：以AFB1-BSA為包被抗原，從1：10000倍開始將抗體進行倍比稀釋，以Sp2／0細胞培養上清為陰性對照，以（A試驗-A空白）／（A對照-A空白）≥21的zui大稀釋倍數為滴定終點；抗體的特異性和抗體的靈敏度用間接競爭抑制性ELISA法進行測定，參試毒素為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、赭曲霉素A（OA）、伏馬菌素B1、T-2毒素和載體蛋白BSA。

 　　試劑盒各項技術參數研究
　　 方法的檢出限（靈敏度）  用間接非競爭ELISA法作抗體滴度測定，找出合適的抗體工作濃度。再用間接競爭ELISA法作棋盤滴定，找出合適的包被濃度與毒素的競爭濃度，zui后作標準曲線，確定線性范圍及檢出限。
 　　方法的回收率試驗  根據試劑盒的檢測范圍確定加標濃度，在不含黃曲霉毒素的玉米和花生樣品中分別進行高、低2個濃度的加標回收試驗，每個加標水平做5個重復的平行樣。樣品的提取方法為：樣品粉碎后使其90％通過250～500μm網篩。稱取5g加到100ml具塞三角燒瓶中，加入05g NaCl及25ml甲醇水溶液（70：30，v／v），劇烈震蕩30min后過濾。濾液用純水稀釋10倍進行檢測。樣品中黃曲霉毒素濃度（μg／Kg）=CDX／W。式中：C-酶標板上測的黃曲霉毒素濃度（ng／ml），根據標準曲線求得；D-樣品提取液的體積（ml）；X-稀釋倍數；W-樣品重量（g）。
 
    黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉（XspeEillusflavus）和寄生曲霉（Aparasiticus）等產生的一組結構類似ELISA試劑盒的次生代謝產物。據Gabal等〔1〕報道，有40％的黃曲霉菌株培養物可同時測出黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）。上海ELISA試劑盒同時黃曲霉毒素的毒性具有協同作用，因此，豬ELISA試劑盒90％以上的國家都制定了食品中總黃曲霉毒素的*。目前總黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層層析法、色譜法。ELISA試劑盒價格我國執行的食品中總黃曲霉毒素B1+B2+G１+G2的國家標準測定方法是薄層色譜法和微柱篩選法，白介素ELISA試劑盒均為目測半定量法，zui低檢出濃度為5μg/kg〔2〕。禽ELISA試劑盒這些方法因受本身的限制，度低、敏感性差；樣品前處理過程復雜費時；或需要價格昂貴的儀器，檢測成本高，難以推廣應用，影響了糧油食品中黃曲霉毒素的有效監測。酶聯免疫吸附法（ELISA）是在免疫學和細胞工程學基礎上發展的一種微量檢測技術，特別適合于對黃曲霉毒素污染監控中大量樣本的篩檢。本研究以B細胞雜交瘤技術以能分泌抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株為基礎，建立了檢測玉米、花生中總黃曲霉毒素的ELISA檢測方法，并初步研制出具有我國自主知識產權的ELISA試劑盒。