定量檢測(cè)總黃曲霉毒素ELISA試劑盒研制

 　　材料與方法
 　　材料 ELISA試劑盒    
　　主要儀器  CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Queue公司）；豬ELISA試劑盒潔凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠）；生物倒置顯微鏡（日本歐林巴斯光學(xué)株式會(huì)社）；酶標(biāo)分析儀（瑞士SUNRIS公司）；ELISA試劑盒價(jià)格電子分析天平（瑞士Mettler公司）；上海ELISA試劑盒低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Hermle公司）；電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）等。

 　　試劑  AFB1-BSA、禽ELISA試劑盒黃曲霍毒素（B+G）（Aflatoxin B+G）、黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）黃曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）白介素ELISA試劑盒、黃曲霉毒素G1（Aflatoxin G1，AFG1）、黃曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）、T-2毒素（T-2toxin）、赭曲霉毒素A（OchratoxinA）、展青霉素（Patulin）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivslenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、匙孔嘁血藍(lán)素（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）、伏馬菌素B1、抗體亞類(lèi)測(cè)定試劑盒（IgM，IgG，IgA，IgD，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3）（美國(guó)Sigma公司）；RPMI1640培養(yǎng)基、選擇性培養(yǎng)基、福氏佐劑（*、不*）、二甲基亞砜（DMSO）、吐溫20（Tween20）、聚乙二醇（PEG，MW5000）、青霉素，鏈霉素（美圍Gibco公司）；辣根過(guò)氧化物酶羊抗鼠IgG（北京中山試劑公司）；30％H2O2（優(yōu)級(jí)純，北京化工廠）。

 　　溶液系統(tǒng)ELISA使用液  參考文獻(xiàn)［3］制備。

 　　細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  小鼠骨髓瘤細(xì)胞系Sp2／0由本室傳代，并經(jīng)8一氮雜鳥(niǎo)嘌呤處理。雌性BALB／c小鼠，體重18～20g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物繁育場(chǎng)）。

 　　抗總黃曲霉毒素雜交瘤細(xì)胞株  本研究室自制。

 　　方法
　　 單克隆抗體生產(chǎn)  將抗總黃曲霉毒素雜交瘤細(xì)胞注入BALB/c小鼠腹腔，獲得含抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的腹水，并將所得腹水采用飽和硫酸銨鹽析法進(jìn)行純化〔4〕。
 　　抗體特性鑒定  抗體的免疫球蛋白類(lèi)別及亞類(lèi)鑒定采用抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒；抗體的純度及分子量用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）測(cè)定；IgG含量采用二喹呆甲酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定；抗體滴度測(cè)定采用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法：以AFB1-BSA為包被抗原，從1：10000倍開(kāi)始將抗體進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)許p2／0細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，以（A試驗(yàn)-A空白）／（A對(duì)照-A空白）≥21的zui大稀釋倍數(shù)為滴定終點(diǎn)；抗體的特異性和抗體的靈敏度用間接競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA法進(jìn)行測(cè)定，參試毒素為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、赭曲霉素A（OA）、伏馬菌素B1、T-2毒素和載體蛋白BSA。

 　　試劑盒各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)研究
　　 方法的檢出限（靈敏度）  用間接非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法作抗體滴度測(cè)定，找出合適的抗體工作濃度。再用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法作棋盤(pán)滴定，找出合適的包被濃度與毒素的競(jìng)爭(zhēng)濃度，zui后作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍及檢出限。
 　　方法的回收率試驗(yàn)  根據(jù)試劑盒的檢測(cè)范圍確定加標(biāo)濃度，在不含黃曲霉毒素的玉米和花生樣品中分別進(jìn)行高、低2個(gè)濃度的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平做5個(gè)重復(fù)的平行樣。樣品的提取方法為：樣品粉碎后使其90％通過(guò)250～500μm網(wǎng)篩。稱(chēng)取5g加到100ml具塞三角燒瓶中，加入05g NaCl及25ml甲醇水溶液（70：30，v／v），劇烈震蕩30min后過(guò)濾。濾液用純水稀釋10倍進(jìn)行檢測(cè)。樣品中黃曲霉毒素濃度（μg／Kg）=CDX／W。式中：C-酶標(biāo)板上測(cè)的黃曲霉毒素濃度（ng／ml），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得；D-樣品提取液的體積（ml）；X-稀釋倍數(shù)；W-樣品重量（g）。
 
    黃曲霉毒素（Aflatoxin）是黃曲霉（XspeEillusflavus）和寄生曲霉（Aparasiticus）等產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類(lèi)似ELISA試劑盒的次生代謝產(chǎn)物。據(jù)Gabal等〔1〕報(bào)道，有40％的黃曲霉菌株培養(yǎng)物可同時(shí)測(cè)出黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2）。上海ELISA試劑盒同時(shí)黃曲霉毒素的毒性具有協(xié)同作用，因此，豬ELISA試劑盒90％以上的國(guó)家都制定了食品中總黃曲霉毒素的*。目前總黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有薄層層析法、色譜法。ELISA試劑盒價(jià)格我國(guó)執(zhí)行的食品中總黃曲霉毒素B1+B2+G１+G2的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法是薄層色譜法和微柱篩選法，白介素ELISA試劑盒均為目測(cè)半定量法，zui低檢出濃度為5μg/kg〔2〕。禽ELISA試劑盒這些方法因受本身的限制，度低、敏感性差；樣品前處理過(guò)程復(fù)雜費(fèi)時(shí)；或需要價(jià)格昂貴的儀器，檢測(cè)成本高，難以推廣應(yīng)用，影響了糧油食品中黃曲霉毒素的有效監(jiān)測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展的一種微量檢測(cè)技術(shù)，特別適合于對(duì)黃曲霉毒素污染監(jiān)控中大量樣本的篩檢。本研究以B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)以能分泌抗總黃曲霉毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)，建立了檢測(cè)玉米、花生中總黃曲霉毒素的ELISA檢測(cè)方法，并初步研制出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的ELISA試劑盒。