質控菌種的管理規定

微生物實驗用菌種是進行新產品研發和生產質量控制的標準物質。為了保證微生物實驗的準確靈敏和人員及環境的衛生安全，特制定以下規定：

1. 菌種采集。實驗室用菌種一是到國家法定機構采購，二是購買ATCC菌種（原代或國內傳代），三是科研中菌種交流。不管是哪種來源，均由公司統一采集。采集中嚴格按照規范執行。要求包裝可靠，采集迅速，不泄漏不污染。保證菌種合格和環境安全。采集中要有菌種傳代標識。

2.菌種的活化：購買的標準菌種必須要求是凍干粉，科研中菌種交流可以為斜面或液體。

菌種的活化是在非選擇性瓊脂培養基上，除非特殊情況或特別推薦，一般不用液體培養基。具體使用培養基的情況如下表，詳細菌種使用方法見附表：

方  法        培養基

方法1        胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），非選擇性羊血瓊脂，PCA或營養瓊脂，35℃正常環境培養24-48小時。

方法2        非選擇性羊血瓊脂，35℃正常環境培養24-48小時。

方法3        巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環境培養24-48小時。

方法4        CDC厭氧血瓊脂35℃厭氧培養48-72小時；部分專性厭氧菌能需要5-7天，才能充分生長；對于梭菌，以下新鮮培養基也可選用：營養瓊脂，TSA瓊脂，PCA瓊脂，需培養48-96小時。

方法5        沙堡氏葡萄糖Emmons瓊脂25-28℃培養3-7天；也可用PDA瓊脂。

方法6        巧克力瓊脂平板，35℃微需氧環境培養48-72小時。

方法7        改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂，35℃5-10%CO2或正常環境培養7天。

方法8        緩沖活性碳酵母提取物瓊脂，35℃正常環境培養3-5天。

方法9        巧克力瓊脂平板，35℃5-10%CO2環境培養48小時。

方法10        先用腦心浸出液肉湯或TSB培養基35℃增菌培養18-24小時，再劃線至TSA瓊脂35℃正常環境培養24-48小時。

方法11        先接種于MRS肉湯35℃增菌培養24-48小時，再劃線接種至含羊血的哥倫比亞CNA培養基35℃5%CO2環境培養24-48小時。

方法12        PDA瓊脂45℃正常環境培養48-72小時。

方法13        先接種于10B精氨酸肉湯，作系列梯度稀釋35℃正常培養至培養基變成粉紅色，接入A-8瓊脂。

3.菌種保存。所有菌種均由實驗室專人（雙人雙鎖）保存于冰箱或其它保存方式。要建立菌種登記臺帳，詳細記錄菌種采集、保管、制備、使用、處置情況；每一種菌種一定要有本公司的檢測鑒定報告（具體的的鑒定方法見ATCC提供的菌種證書方法）；具體菌種保存方法如下：

3.1 干粉菌種：購買的干粉菌種保存于2-8℃冰箱中，可保存3-5年。

3.2 斜面菌種或液體菌種：

3.2.1 液氮罐保存方法：用于*代菌種的長期保存，每種菌種保存5管。

（1）準備用于液氮保藏的安瓿管或菌種保存管（塑料），要求能耐受溫度突然變化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液體的。

　　（2）加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細胞時，則將空安瓿管塞上棉塞， 121℃滅菌15分鐘：若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用121℃滅菌15分鐘。

　　（3）接入菌種：將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管；霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內切取菌落圓塊，放入含有保護劑的安瓿管內，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

　　（4）凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃。若細胞急劇冷凍，則在細胞內會形成冰的結晶，因而降低存活率。

　　（5）保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內。液氮保藏器內的氣相為-150℃，液態氮內為-196℃。

　　（6）恢復培養保藏的菌種需要用時，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內容物移入適宜的培養基上培養。

　　此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏，而且性狀不變異。

3.2.2 液體石蠟保存法：將液體石蠟分裝于三角燒瓶內，塞上棉塞，并用牛皮紙包扎， 121℃滅菌30分鐘，然后放在40℃溫箱中，使水汽蒸發掉，備用。將需要保藏的菌種，在zui適宜的斜面培養基中培養，使得到健壯的菌體或孢子。用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟，注入已長好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1cm為準，使菌種與空氣隔絕。將試管直立，置低溫或室溫下保存（有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長）。

1）大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、假單胞桿菌屬、沙門氏菌屬、副傷寒沙門氏菌、李斯特氏菌屬、蠟樣芽胞桿菌、八疊球菌、短芽孢桿菌、大腸桿菌HB101、大腸桿菌DH、豬肺疫、禽多殺性巴氏桿菌（禽霍亂）、豬丹毒、大腸桿菌O157、大腸菌群、產氣腸桿菌、志賀氏菌屬；接種于半固體培養基上，36±1℃培養18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

注：副溶血性弧菌接種于含鹽的半固體培養基上，36±1℃培養18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于室溫。

2）產氣莢膜梭菌、梭桿菌屬、擬桿菌屬等厭氧菌、厭氧消化鏈球菌：接種于CDC厭氧菌瓊脂中，培養18-24小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

3）酵母菌：接種于YPD培養基中，28℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

4）霉菌、白色念珠球菌：接種于PDA培養基中，28℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

5）鏈球菌屬：接種于羊血瓊脂，36±1℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

6）副嗜血桿菌、淋病奈瑟菌（需5-10%CO2環境）、腦膜炎奈瑟菌（需5-10%CO2環境）、流感嗜血桿菌接種于巧克力瓊脂，36±1℃培養24-48小時，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

7）分枝桿菌屬：接種于改良羅氏瓊脂或Middlebrook瓊脂36±1℃培養7天，加入無菌石蠟油覆蓋，保存于2-8℃冰箱或室溫中。可保存1-2年。

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