流式細胞技術常見問題與回答

1、流式細胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的？
FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度， FL2-H是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應用，用于去除粘連細胞。

2、流式同型對照怎樣選擇？
同型對照（Isotype Control）：使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（與一抗相同的正常血清） （must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組來源不同，應選用相同來源的未標記單抗作為同型對照來調整背景染色。舉個例子：比如檢測一抗為單抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a， 所以可以用purified（純化的） mouse IgG2a來做OX-42的同型對照（Isotype Control）。一般的的生物技術公司和國內的代理都有出售。

同型對照：是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類，若使用直接免疫熒光染色法，同型對照也應標記熒光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考慮了細胞的自發熒光、FC受體介導的抗體結合和非特異性抗體結合等影響因素。此外，同型對照與MoAb所標記的熒光色素、濃度、F：P比值（標記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值）應該相同為*，這對準確設定陰性與陽性細胞的界標有重要意義，切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照，為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備（如同一品牌）的產品。

3、流式細胞技術測定細胞內游離鈣濃度為何要使用氯化鈣.在文獻及其他專業中都有測定游離鈣的方法，具體如下：
（1） 鈣熒光探針負載；
（2）隨機測定每管細胞懸液樣品（以下簡稱樣品）的單個細胞的熒光強度，記為F值。
（3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化鈣，（問題所在），吹打均勻，孵育1~10min，測定熒光即Fmax值。
（4）加入EGTA，20%26mu;l（鈣螯合劑），孵育1~10min，激發波長488nm測定熒光，即Fmin值。
這個過程中的氯化鈣的作用如何， 請高人指點， 謝謝。
因為正常血漿中Ca2＋濃度是1mM，細胞外液的Ca2＋對細胞內Ca2＋有影響。加0.1%triton是增加膜通透性，使細胞外Ca2＋進入細胞內，作為zui大值。加EGTA是為了螯合Ca2＋，作為zui小值.生理環境中細胞內鈣離子濃度遠低于細胞外液（大約1：10000），細胞膜對鈣的通透性變化對細胞內鈣影響很大。

4、流式與werstern的區別，知道一些，不足之處請大家補充：
（1）Western 是檢測蛋白表達的金標準，可用于檢測細胞多種類型的蛋白；流式細胞術的方法多用于檢測細胞膜蛋白，雖然也可通過Triton-X100給細胞打孔的方法來檢測胞內蛋白，但對于分泌蛋白卻是無能為力的；
（2）Western測蛋白含量對抗體的量需要很少，一般1：1000左右，而流式對抗體的需要量很大，一般1：50（很浪費抗體）；
（3）采用Western方法檢測細胞蛋白含量的變化一般要有內參，而流式一般要把每個樣品分為兩份，同時都做只加二抗（FITC標記的）的對照，這樣平均到每個細胞的發光就不用內參了；
（4）就個人經驗而言，流式用多抗不好，單抗標出來不錯。
不過流式的應用原理主要還是抗原和抗體反應和western、免疫組化沒有本質差別，但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系，因此，流式不適合檢測低表達的蛋白，低表達的還是采用western（尤其是化學發光底物更佳）和免疫組化更好。當然，流式zui大的一個特點就是，可以定量（百分比），如果是高表達的用流式細胞儀非常有優勢。

5、FL1， FL2， FL3 的區別是什么? 是指在不同位置測得的熒光?還是不同波長的熒光?這3個參數到底測的是什么?有什么意義?
其實FL1， FL2， FL3 是指不同的熒光通道.舉個例子來說吧.我們用FITC/PE雙標記的細胞，在488nm的激光激發下，這兩種熒光染料分別發出波長不同的綠色和橙色熒光，然后這發出的熒光再通過濾光片分開，對應的是不同的波長的濾光片，一般在fl1那的是530nm的濾光片，在FL2那的是575nm的濾光片，這樣就可以把在一起的熒光分開了。
6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細胞術？
看你說明書上是怎么說的了，如果沒有說就不可以做流式，需要另外買了。
7、MFI和GFI的意義？
Geo Mean，叫做幾何均數（geometric mean），常用于等級資料和對數正態分布資料，和常用的算數均數（mean）的計算方法不同。%26ldquo; %total或者%gate的結果%26rdquo;代表的是百分率，即細胞占總體細胞或者是門內細胞的百分比；用百分比作為統計指標，適用于熒光表達較強的指標。我看到你的流式圖上，檢測樣本的熒光強度不是很強，屬于弱表達的指標，若用百分率統計，就是會失去一部分弱陽性的數據。我建議可以用平均熒光強度（也就是mean值）作為統計指標，比較熒光強度的變化。
8、流式技術中的APC，pure 標記是什么意思呢?
熒光物質通常是指那些在受到一個波長激發后，處于一個能量不穩定的狀態，能發射一個波長比激發波長長的光的一類物質。當然熒光并不都是受激發后發射的，如一些生物可以發射熒光，如熒火蟲，發光細菌等，他們發出的光是通過體內的酶促反應而產生的，這個酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質，它在受到紫外線照射后可以發出一可見光，常用于DNA、RNA電泳中。
APC
英文全名：allophycocyanin；中文名：別藻青蛋白；zui大吸收峰：650nm，zui大發射熒光峰：660nm，適用于雙激光流式儀，可被600-640nm波長的激光激發。
PerCP
英文全名：peridinin chlorophyll protein，中文名：多甲藻葉綠素蛋白；zui大激發波峰490nm，被488nm的氬離子激光激發后，發射光峰值約為677nm，與FITC、PE進行多色熒光染色補償重疊較少，非特異性結合也較少。雖然較易使用，但量子產量不高，多用于檢測表達較高的抗原。
9、怎樣用流式細胞儀來鑒定小鼠BMDC？
檢測小鼠BMDC主要是從形態學和細胞表面分子兩方面來鑒定我做的時候就做了普通光鏡下形態、電鏡（掃描和透射），另外檢測了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86 、CD11、CD80。還做了MHC II類分子的檢測，還有MHCI類分子的檢測，這些分子在DC表面都不是特異存在的，在巨噬細胞、淋巴細胞表面也有表達，所以目前并沒有非常特異性的方法檢測你的細胞一定就是DC，但是從形態和表面分子的檢測結合來看，效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達水平較低，DC成熟過程中，上述分子表達呈上調趨勢，你可以在不同的培養時間分別檢測。