人甲狀腺細(xì)胞株

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MTT點(diǎn)板時(shí)一定要將細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，而且一定要混勻，用排槍，否則，MTT的SD會(huì)狂大！

2、點(diǎn)板布局

其實(shí)這一點(diǎn)很多人不懈一顧。如果你的細(xì)胞要養(yǎng)48 h或更長(zhǎng)，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個(gè)邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個(gè)孔的水分。因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)過程中，邊孔的水分蒸發(fā)很快，培養(yǎng)液及里面的藥物會(huì)出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，細(xì)胞的狀況就復(fù)雜了，有些人稱之為%26ldquo;邊緣效應(yīng)%26rdquo;這些孔的SD也會(huì)狂大，既然如此，不如不用。

3、加MTT

如果確認(rèn)你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強(qiáng)，比如谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建議你用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。

4、加入MTT后的反應(yīng)

時(shí)間為3-4h，此時(shí)棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉淀溶解*，盡可能將水棄除干凈，加入DMSO后在搖床上震搖10min。提醒：如果你的細(xì)胞貼壁不好，此時(shí)的沉淀在棄去液體時(shí)易丟失，因此貼壁不好的細(xì)胞在點(diǎn)板時(shí)記得將96孔板用多聚賴氨酸處理處理，要么在棄液體時(shí)先用甩板機(jī)離心，再輕輕棄去液體。關(guān)于DMSO的量，每孔的體積有點(diǎn)兒差異不干擾檢測(cè)，只要能將沉淀*溶解就行了。至于DMSO的體積差異不同為什么不影響檢測(cè)值已經(jīng)被數(shù)學(xué)證明了，在此我不多說，如果有人不明白我再證明給他看。當(dāng)然為了養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣，DMSO的體積還是一致的好。

5、檢測(cè)MTT

還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標(biāo)儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標(biāo)儀有單波長(zhǎng)，你可以在檢測(cè)前掃描一下吸收譜，選用zui大細(xì)說波長(zhǎng)檢測(cè)就是了，zui大波長(zhǎng)，大概在550nm附近，必要時(shí)加一個(gè)參比波長(zhǎng)以扣除非特異性吸收。

6、吸收值分析

在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理組的吸收值應(yīng)該在0.8-1.2左右，太小檢測(cè)誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經(jīng)超出線性范圍。這個(gè)原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

7、建議

如果你覺得MTT中出現(xiàn)的問題不好解決，那么建議你做CCK-8實(shí)驗(yàn)，原理與MTT相似，但操作上簡(jiǎn)化些，當(dāng)然，費(fèi)用也稍微高一些。

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