GIBCO 10099-141

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外泌體（Exsome）發(fā)展歷程：

外泌體的發(fā)現(xiàn)要追溯到1986年，Eberhard G. Trams和R.M.Johnstone在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)了一種有膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，并將其命名為Exosome（外泌體）。隨后的10年，外泌體并未受到足夠的重視。直至1996年，G.Raposo發(fā)現(xiàn)類似于B淋巴細(xì)胞能分泌抗原提呈外泌體，這種外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和粘附因子。研究表明這種B細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以直接刺激效應(yīng)CD4+細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)。1998年，L.Zitvogel等發(fā)現(xiàn)樹(shù)突細(xì)胞（DC cell）也能產(chǎn)生有抗原提呈能力的外泌體，而且外泌體含有功能性的MHC-Ⅰ類和Ⅱ類分子，還有共刺激因子。這種外泌體啟動(dòng)了特異性的CTL殺傷作用，促進(jìn)了T細(xì)胞依賴的抗腫瘤效應(yīng)。

2007年，H.Valadi等發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞之間可以通過(guò)外泌體中的RNA來(lái)交換遺傳物質(zhì)。這意味著細(xì)胞可以通過(guò)外泌體影響另外一個(gè)細(xì)胞，甚至可以把自己的基因強(qiáng)加給另外一個(gè)細(xì)胞。研究人員逐漸對(duì)小小的外泌體產(chǎn)生了極大的好奇。他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的外泌體與正常細(xì)胞的外泌體之間存在差異，腫瘤的外泌體會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，腫瘤周圍組織細(xì)胞分泌的外泌體具備殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，等等。2013年的諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了三位科學(xué)家，他們分別是美國(guó)科學(xué)家James E. Rothman和Randy W. Schekman，德國(guó)科學(xué)家Thomas C. Südhof，以表彰他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)部囊泡（外泌體等）運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制。使外泌體的研究達(dá)到全新的高度。就外泌體的研究方向而言，干細(xì)胞、免疫、microRNA、靶向給藥、癌癥的診斷及治療等都是熱門研究領(lǐng)域。

2015年JHuan等人證實(shí)了急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）的外泌體在白血病的骨髓微環(huán)境中具有抑制造血干細(xì)胞的功能。同年WANGY等人發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞的外泌體可以在心肌細(xì)胞受到急性心肌缺血（MIR）影響時(shí)，給心肌細(xì)胞傳送保護(hù)信號(hào)。

目前，已有越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注外泌體在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用及其機(jī)制，外泌體將在癌癥的診斷及治療等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。2015年德克薩斯大學(xué)MD安德森癌癥中心的一項(xiàng)研究在6月24日的《自然》（Nature）雜志上發(fā)布，研究發(fā)現(xiàn)存在于癌癥外泌體（exosomes）上的glypican-1 (GPC1)基因編碼蛋白，或許可以作為一種潛在非侵入性診斷和篩查工具的組成部分，用來(lái)檢測(cè)有可能尚處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌小鼠模型還未顯示出MRI可以檢測(cè)到的胰腺疾病跡象之時(shí)，GPC1+ crExos就檢測(cè)到了胰腺癌的可能性。相比常用的CA 19-9生物標(biāo)志物，GPC1+ crExos似乎是一種更可靠的篩查工具。

“不同于循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)需要大量的新鮮血液，在大約30年前保存到冷凍庫(kù)的血液樣本中也可以檢測(cè)和分離出GPC1+ crExos?？梢詮膬?chǔ)存樣本分離出的癌癥外泌體中提取出DNA、RNA和蛋白質(zhì)，用于進(jìn)一步的遺傳和生物分析。因此，癌癥外泌體不僅僅是一種生物標(biāo)記物，分離出它們還可為我們提供一個(gè)癌癥特異性信息的寶庫(kù)。”由于胰腺癌確診時(shí)常常已到晚期，只有15%的患者適合于接受手術(shù)。如果能夠早期檢測(cè)到癌癥，就可以采用胰十二指腸切除術(shù)來(lái)治療胰腺癌患者。

目前有關(guān)外泌體的研究，主要集中在外泌體顆粒的提取、純化和內(nèi)容物分析上。其中，外泌體的粒徑表征和濃度信息是極為重要的參數(shù)。

外泌體的分離

目前，外泌體的分離多采用超速離心、磁珠免疫捕獲、沉淀或過(guò)濾三種方法。

超速離心：耗時(shí)耗力，往往需要8-30個(gè)小時(shí)；每次zui多只能處理6個(gè)樣品；需要大量的起始材料；產(chǎn)量不高。需一臺(tái)超速離心機(jī)。

磁珠免疫捕獲：利用外泌體表面*的表面標(biāo)記物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育后結(jié)合，即可將外泌體吸附并分離出來(lái)。磁珠法具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、不影響外泌體形態(tài)完整等優(yōu)點(diǎn)，但是效率低，外泌體生物活性易受pH和鹽濃度影響，不利于下游實(shí)驗(yàn)，難以廣泛普及。

外泌體分離：

通過(guò)簡(jiǎn)單離心，從體液、血液、尿液、細(xì)胞中分離外泌體（Exosome），相比超速離心，安全、快速，經(jīng)過(guò)兩次柱子純化，很好的去除了白蛋白，從而獲得高純度和高產(chǎn)量的外泌體。

外泌體RNA/蛋白的分析

目前，通常使用組織診斷法進(jìn)行癌癥檢測(cè)，如熒光原位雜交（FISH）和免疫組織化學(xué)（IHC）。但是這樣基于組織診斷的方法具有很大的局限性，因?yàn)樾枰^大量的組織樣本，其不能對(duì)癌癥變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，不能準(zhǔn)確地反映當(dāng)前的疾病狀態(tài)。而外泌體診斷測(cè)試通過(guò)從尿液、血液和體液中提取的外泌體獲得遺傳信。Exosomes是由所有含RNA、DNA和蛋白的活細(xì)胞釋放的信使。因?yàn)镋xosome包含來(lái)源于母細(xì)胞的信息，因此在腫瘤學(xué)上，基于外泌體的體液活檢對(duì)整個(gè)腫瘤活動(dòng)提供了一個(gè)實(shí)時(shí)監(jiān)控并可對(duì)疾病的重要變化進(jìn)行檢測(cè)。

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